Técnica de PCR

Veja na prática o passo a passo de como é feita a técnica de PCR.

Participação da professora de genética da Universidade Federal da Bahia (UFBA), Renata Ferreira de Lima.

Reação em cadeia da polimerase - PCR

A técnica de PCR é um advento relativamente recente na história da biologia molecular, tendo sido desenvolvida nos anos 80 por Kary Mullis.
Na década de 1980, passou-se a utilizar a técnica do PCR para fazer milhares de cópias de um único pedaço de DNA. Essa técnica é usada em tubos de ensaio contendo o DNA e mais alguns compostos necessários, como primers (DNAs iniciadores) e a enzima DNA polimerase (enzima que faz a replicação do DNA). Os primers são fitas de DNA, com mais ou menos 20 bases (A, T, C, G) complementares, isto é se ligam por complementaridade ao início da seqüência de DNA que se quer multiplicar. Quando uma molécula de DNA vai ser multiplicada deve-se separar a dupla fita, formando assim duas fitas diferentes mas complementares entre si. Cada fita servirá de molde para a duplicação, por isso, precisamos de dois tipos de primers diferentes.
Veja as figuras clicando em figura 1 e figura 2.

Passo a passo do processo da inserção do DNA num plasmídio

1. Os pesquisadores querem estudar um gene humano que produz uma proteína que não se sabe a função.
2. Os pesquisadores “recortam” (utilizando enzimas de restrição), do DNA humano, o gene de interesse.
3. Esse fragmento de DNA contendo o gene é multiplicado por PCR para obtermos várias cópias do mesmo fragmento (ou da mesma informação).
4. A mesma enzima que clivou o gene do DNA humano é utilizado para clivar o plasmídio bacteriano. Lembre-se que o fragmento de DNA, ao ser clivado, gera pontas adesivas que são complementares ao plasmídio se este for clivado com a mesma enzima.
5. A seguir o plasmídio clivado é misturado com os fragmentos de DNA (contendo o gene) e uma enzima chamada ligase “cola” os fragmentos ao plasmídio, produzindo o chamado DNA recombinante. Isso feito, o DNA recombinante é introduzido em uma bactéria hospedeira.
6. A bactéria hospedeira é colocada em um meio nutritivo seletivo, apenas aquelas que possuem o DNA recombinante crescem, formando colônias. Após muitas gerações de bactérias, o produto da expressão dos genes, as proteínas humanas, são purificadas das bactérias (são separadas das proteínas das bactérias).

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Esse método produz uma grande quantidade de proteínas humanas possibilitando assim, seu estudo.

A tecnologia do DNA recombinante

Cada fragmento de DNA, que foi clivado e separado do resto do material genético, contém um ou mais genes. Lembre-se que cada gene origina uma proteína, portanto ao estudarmos o gene estamos estudando a proteína que ele codifica.

Mas o que devemos fazer para estudar o gene?

Devemos introduzi-lo no material genético (no DNA) de um hospedeiro para que ocorra a transcrição do gene, em mRNA, e a tradução em proteína.

O hospedeiro é um organismo que se multiplica (se reproduz) rapidamente, como por exemplo, as bactérias. Quando as bactérias se reproduzem por bipartição elas transmitem ao seus “filhos” o seu material genético, portanto se neste material conter o fragmento de DNA de estudo, em pouco tempo teremos milhões de bactérias com o gene.

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O plasmídio é o matérial genético circular não ligado ao cromossomo que fica espalhado pelo hialoplasma das bactérias. Ele sofre o mesmo processo do DNA cromossomal de transcrição e tradução, além de, se multiplicar a cada divisão celular, passando uma cópia para cada célula “filha”.

O plasmídio é retirado das células bacterianas para que se possa inserir o gene de estudo, para depois recoloca-lo na bactéria.

Inserção de DNA estranho num plasmídio. Clique aqui.

Técnica de PCR, passo a passo:

1. A amostra de DNA, a enzima que faz a replicação (DNA polimerase), os nucleotídeos de DNA e os primers complementares a seqüência de DNA são colocados em um tubo de ensaio.
2. Coloca-se o tubo de ensaio em uma máquina de PCR (maquina que aumenta e diminui a temperatura de acordo com um programa). Os passos seguintes, de aquecimento e resfrimento, acontecem dentro da máquina controlados pelo programa.
3. Aquece-se o tubo a 94ºC para desnaturar (separar a dupla fita) o DNA.
4. Cada fita simples do DNA que foi desnaturado serve de molde para a síntese de novas cadeias complementares. Para isso resfria-se a 54ºC onde os primers se anelam ao início das duas fitas simples, servindo de iniciadores para a enzima polimerase.
5. Aquece-se novamente o tubo a 72ºC (temperatura ideal de funcionamento da DNA polimerase) para a duplicação da fita. A DNA polimerase inicia, após o final do primer, a colocar os nucleotídeos livres na fita de DNA ligando-os por complementariendade, formando assim uma nova fita dupla.